style="width:5.36664in;height:3.77322in" /> 本文是学习GB-T 34738-2017 蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR 检测方法。
本标准适用于蜜蜂及其幼虫中囊状幼虫病的检测。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所有试剂均用无RNA
酶污染的容器(用焦碳酸二乙酯水处理
后高压灭菌)分装。
3.1 水 ，GB/T 6682,三级。
3.3 引物和探针，上游引物F1(10 pmol/μL):5'-AAG TTG GAG GCG CGY ATT
TG-3',下游引物 R1(10 pmol/μL):5'-CAA ATG TCT TCT TAC DAG AAG YAA GGA
TTG-3',探针 P1(5 pmol/μL):
5'-FAM-CGG AGT GGA AAG AT-TAMRA-3'。
3.4 磷酸盐缓冲盐水，配制方法见A.1。
注：用新开启的无水乙醇和焦碳酸二乙酯水配制。
3.11 RNA 酶抑制剂(40 U/μL)。
3.13 10×PCR 反应缓冲液(含镁离子)。
3.14 DNA 聚合酶(5 U/μL)。
3.15 三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNPTs 每种浓度均为10 mmol/L)。
GB/T 34738—2017
4.2 台式冷冻高速离心机(离心速度12000 r/min 以上)。
4.3
微量可调移液器(100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL)及配套带滤芯
吸头。
开箱，提蜂脾查看，出现下列病理变化特征之一者，可判为疑似：
a)
脾面上会出现卵、小幼虫、大幼虫、封盖子排列不规则的现象，即所谓"花子脾"现象。
b)
病害严重时，病虫多，工蜂清理不及，可以在脾面上见到病虫巢房被工蜂咬开，巢房盖有大量不
规则孔洞，露出患病幼虫上翘的头部呈"尖头"状，其头部有大量的透明液体聚积。
c)
用镊子小心夹住幼虫头部将其提出，可见虫体末端明显的囊状袋，虫体苍白色、无味、无黏性，
参见附录B。
在临床诊断时应注意将本病与美洲幼虫腐臭病相区别，其鉴别诊断要点参见附录
B。
6.1.1 按 GB/T 18088
要求，采集疑似感染的蜜蜂幼虫20只～30只，也可采集以下样品：
a) 蜂巢内病变区域成蜂20只～30只，或
b) 不小于20 cm² 的蜂房，或
c) 取临近蜂巢的蜂蜜、花粉及小幼虫和底部的王浆等蜜蜂食物(30 g～50 g)。
6.1.2 采集的样品分别装入无菌的容器中，加入5倍～10倍样品体积的RNA
保存液，尽快转移到液氮
中保存，供检测用。
6.2.1
在洁净、灭菌并烘干的研钵内，加入蜜蜂3只～5只(或幼虫3只～5只，或蜂房10 g
左右，或蜜 蜂食物10 g 左右),同时加入 PBS(10mL) 和 RNA
酶抑制剂(终浓度为100 U/mL), 混匀并充分研磨。
6.2.2 4 ℃、3000 r/min 离心15 min。
6.2.3 取上清液，转入无菌离心管(1.5 mL) 中，编号备用。
阴、阳性样品的制备方法见附录 C。
GB/T 34738—2017
6.3.2.1 取灭菌的1.5 mL 离心管，编号。
6.3.2.2 每 管 加 入 6 0 0 μL 总 RNA
抽提试剂裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各 200μL,
一份样本换用一个吸头，再加入200μL 氯仿，涡旋震荡器上振荡混匀5
s(不能过于强烈，以免 产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。
6.3.2.3 4 ℃ 、12000 r/min 离心15 min。
6.3.2.4 取上清液转移至灭菌的1.5 mL
离心管中，编号，加入等量的异丙醇(一20℃预冷),颠倒混匀。
6.3.2.5 4 ℃ 、12000 r/min 离心15 min,
离心管开口朝向离心机转轴方向。
6.3.2.6 小心倒去上清，加入600μL
焦碳酸二乙酯处理水配制的75%乙醇，颠倒洗涤。
6.3.2.7 4 ℃ 、12000 r/min 离心10 min。
6.3.2.8
小心倒去上清，离心管倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。
6.3.2.9 立即进行cDNA 的合成或 - 70℃保存备用。
注： 本条所有操作在冰盒上进行。
6.3.3.1 在6.3.2.8的离心管中依次加入随机引物2μL,
焦碳酸二乙酯处理水12μL; 轻微振荡，瞬时
离心。
6.3.3.2 70℃作用10 min, 冰浴2 min。
6.3.3.3 3000 r/min 离心1 min。
6.3.3.4
在超净台内，向离心管中依次加入：5×反转录酶缓冲液4μL,
三磷酸脱氧核糖核苷酸1μL, RNA 酶抑制剂0.5μL, 反转录酶0 .5μL, 瞬时离心。
6.3.3.5 4 2 ℃ 作 用 1 h,70℃ 作用15 min, 冰 浴 3
min, 瞬时离心，产物为 cDNA, 立即进行 PCR 扩增或 -20 ℃保存备用。
6.3.4.1 在 PCR 管中，依次加入以下试剂：10×PCR
缓冲液2.5μL、三磷酸脱氧核糖核苷酸1μL 、DNA 聚合酶0.5μL、引 物 F11μL、 引
物F21μL、 探针1μL、cDNA 2μL、焦碳酸二乙酯处理水16μL; 盖紧管 盖，500
r/min 离心30 s。
6.3.4.2 离心后的 PCR 管放入荧光RT-PCR
检测仪内，记录样本摆放顺序。
6.3.4.3 设置循环条件：50℃2 min,1 个循环；95℃10
min,1 个循环；95℃15s,55℃1min,40 个 循
环，退火延伸时收集荧光。
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品
扩增曲线的最高点为准。
阴性对照无Ct 值并且无扩增曲线，且阳性对照的Ct
值\<28.0,并出现典型的扩增曲线。
6.4.3.1 阴性：符合6.4.2的条件，无Ct
值并且无扩增曲线，结果判为阴性；表示样品中无蜜蜂囊状幼虫
GB/T 34738—2017
病病毒。
6.4.3.2
病病毒。
6.4.3.3
阳性：符合6.4.2的条件，Ct
值≤30.0,且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在蜜蜂囊状幼虫
有效原则：Ct 值>30 .0的样本建议重做。重做结果无Ct
值者为阴性，否则为阳性。
符合5.1的临床特征，且6.3荧光RT-PCR
检测结果出现6.4.3的阳性结果，可确诊为蜜蜂囊状幼
虫病阳性。
GB/T 34738—2017
A.1 磷酸盐缓冲盐水配制
A.1.1 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液
磷酸二氢钠(NaH₂PO ·H₂O)27.6g,
A.1.2 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液
(规范性附录)
溶 液 配 制
溶于蒸馏水中，最后稀释至1000 mL。
七水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ ·7H₂O)53.6g,
二水磷酸氢二钠(Na2HPO₄ ·2H₂O)35.6g
或十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ · 12H₂O)71.6
加蒸馏水溶解，最后稀释至1000 mL。
g 或
A.1.3 0.01 mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲盐水的配制
0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液14 mL,0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液36 mL,
加氯化钠(NaCl)
8.5g, 用蒸馏水稀释至1000 mL,121℃,15
min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各
A.2 焦碳酸二乙酯处理水
用超纯水按0.1%加入焦碳酸二乙酯，室温静置过夜，115℃,20 min
高压灭菌，冷却备用。
GB/T 34738—2017
(资料性附录)
蜜蜂囊状幼虫病
B.1 蜜蜂囊状幼虫病
蜜蜂囊状幼虫病(Sacbrood
disease)简称囊幼病，又叫尖头病、囊雏病，是由囊状幼虫病毒
(Sacbrood bee
virus,SBV)引起的蜜蜂幼虫肠道传染病，也是中蜂的主要病害之一。
B.2 病原
病原为囊状幼虫病毒，属于传染性软腐病病毒科
Iflaviridae,传染性软腐病病毒属 Iflavirus,正
链 RNA 病毒，病毒粒子直径28 nm, 无囊膜，圆形。
B.3 症状
SBV 主要感染幼虫使其致病死亡。
一般在1～2日龄小幼虫阶段侵入，在5～6日龄大幼虫阶段出
现明显的症状，也可在成蜂体内繁殖，但不表现出症状。 SBV
一般在1～2日龄小幼虫阶段侵入，在中
肠细胞、脂肪细胞、王浆腺细胞和气管等组织中大量增殖，被害幼虫无法化蛹，
一般都在幼虫封盖前后表
现症状，感染幼虫失去光泽，然后软塌下陷，贴于巢房下半部，头部离开巢房壁翘起，形成钩状幼虫，虫体
由苍白色逐渐变为淡褐色，由于虫体后部皮下渗出液增多，用镊子夹出呈现典型的囊状，如图B.1
所示。
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图 B.1 患蜜蜂囊状幼虫病的幼虫[1]
B.4 鉴别诊断
在临床诊断时应注意将本病与美洲幼虫腐臭病相区别。美洲幼虫腐臭病又称为"烂子病",是由幼
虫芽孢杆菌引起的一种幼虫的细菌性传染病，和囊状幼虫病有相似之处，它们都是引起封盖后的幼虫大
量死亡，但这两种疾病各有特点，应注意区别(见表B.1)。
GB/T 34738—2017
表 B.1 蜜蜂囊状幼虫病与美洲幼虫腐臭病临床诊断时的区别要点
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GB/T 34738—2017
(规范性附录)
蜜蜂囊状幼虫病毒阳性样品和阴性样品
C.1 阳性样品制备
取蜜蜂囊状幼虫病毒标准毒株按说明书稀释，按体积1:4加入总RNA
抽提试剂灭活，剧烈震荡
1min, 再冰浴10 min,用10倍体积的磷酸盐缓冲盐水稀释，0.5 mL/
管分装，液氮保存备用。
C.2 阴性样品制备
取健康蜜蜂幼虫，按体积1:4加入总 RNA 抽提试剂灭活，剧烈震荡1 min,
再冰浴10 min, 用
10倍体积的磷酸盐缓冲盐水稀释，0.5 mL/ 管分装，液氮保存备用。
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